1、什么是iTRAQ？
iTRAQ技術，即同位素相對標記與絕對定量技術。該技術可對復雜樣本、細胞器、細胞裂解液等樣本進行相對和絕對定量研究，具有較好的定量效果、較高的重復性。由于其能夠同時對多達8種樣品進行標記分析，故在生命科學的各個領域得到了廣泛的應用。
2、iTRAQ的原理是什么？
iTRAQ的檢測可以做這樣的比喻，蛋白被打成肽段后，被平均的鋪在了一個有384個孔的平板上，然后機器會從每個孔中選取濃度在前5名的蛋白進行鑒定和比對，所以，如果假設每個一個樣本中有100個蛋白，他們的濃度均為1%，那么得到的結果就是蛋白的得分低，但是鑒定的蛋白數量會很多，可以達到90以上；如果一個樣本中有100個蛋白，有3個蛋白的含量分別為30、20、10、其他的97鐘蛋白為剩下的50%，那么這三種蛋白的得分高，但是鑒定出的蛋白數量會比較少，也許只有50或者60個。因為一些高豐度的蛋白會大量分部在上述的小孔中，抑制了其他蛋白的檢出效果。
3、iTRAQ的主要優勢有哪些？
(1) 高通量
一次性定性和定量該樣本的總蛋白，不用像雙向電泳(2DE)或DIGE要逐個斑點做鑒定；2DE可分離1500-2500個斑點(并且可能很多斑點對應同一種蛋白)，而iTRAQ一般可鑒定2000種以上蛋白，其中常規動物組織或細胞可鑒定到4000-7000種蛋白；
(2) 結果直觀、分析靈活
直接得到蛋白的定性和相對定量信息，可利用統計學方法快速篩選出各個組別的差異蛋白；能更好的結合基因組或轉錄組的數據，十分有利于后續研究。
(3) 對樣本類型無限制
任何類型的樣本均可做，當然數據庫越全、鑒定到的蛋白種類越多；對于罕見物種，可提供轉錄組數據來檢索，更容易找到有意義的蛋白。
(4) 加了數據的可靠性和相關性
一次上機的樣本數高達8個，如果樣本數多于8個，還可以在每次上機時設置內參，每個樣本先跟內參比較，再相互比較(排除操作、環境和儀器誤差)，從而實現多組樣本間的差異蛋白分析。
4、iTRAQ與其他蛋白質組學技術的區別是什么？
雙向電泳是最早、最經典的蛋白質組技術，適用于大部分樣本，只是對強酸或強堿性蛋白，以及分子量太大或太小的蛋白質分離效果不好；另外由于各個樣本需要單獨跑膠，很難避免操作誤差對結果的影響，可能導致定量不準確；但是雙向電泳的服務價格相對便宜，可以用于樣本差異的初步篩選；
DIGE在雙向電泳基礎上做了改進，引入了熒光標記物和內標，可以使定量更加準確；但該技術也是依據蛋白的等電點和分子量分離，因此對強酸或強堿性蛋白，以及分子量太大或太小的蛋白質分離效果也不好。
iTRAQ、TMT、label-free和SILAC都是利用液質聯用技術來尋找差異蛋白。其中，iTRAQ和TMT的原理和檢測方法基本一致，只是使用了不同的標記物；TMT有10種標記物，可對多達10種不同樣本進行分析，但是由于其標記物的質量數非常相近，因此必須使用超高分辨率的質譜才可以滿足檢測，這也必然會導致信號干擾更多，可能會影響定量的準確性；label-free是非標記的蛋白質組學技術，由于沒有標記物，其定量需要依賴于操作和質譜儀的穩定性，該技術鑒定到的蛋白數目會少于iTRAQ技術，并且定量的準確性較差，優勢是服務費用較低；SILAC是基于穩定同位素標記的細胞培養技術的蛋白質組學方法，利用不同的同位素培養基來培養不同組別的細胞，達到體內標記的目的，其定量準確性要比其他蛋白質組學技術更高；但是由于缺乏合適的同位素培養基，該方法基本只能用于可傳代的哺乳動物細胞系。
從定量準確性、應用性等各方面綜合考慮， iTRAQ技術已成為近年來利用最廣泛的蛋白質組學技術。
5、iTRAQ實驗對樣本有何要求?
任何類型的樣本都可以，如果是罕見物種，可以用近緣物種的數據庫檢索，也可提供轉錄組數據庫來檢索；一次上機，每組樣本需要用200μg蛋白，但由于需要蛋白定量檢測和預實驗，因此每組樣本所需的蛋白量大概在500μg左右；我公司負責蛋白質的提取，客戶只需要提供足夠的原始樣本。
6、不同類型的樣本做iTRAQ能否一次上機？
不能。如果樣品來源于不同物種，檢索時就無法選擇數據庫，也就無法分析數據；即使是同一物種的樣本，它們的蛋白種類和豐度也可能有很大差別(比如植物的根和葉)，將這些酶切肽段混合上機，其數據會相互干擾，導致蛋白定性和定量的不準確。
7、iTRAQ實驗是否需要設置重復？
通常重復包括生物學重復和技術重復，iTRAQ中常說到的還有上機重復；生物學重復即樣本重復，采集來源于同一組別的不同樣本(例如同樣處理的不同植物、同一疾病的不同患者血清等)，通常設置3個生物學重復，但臨床樣本一般要求生物學重復更多(如疾病組和健康組各十幾例樣本)；當生物學重復的樣本很多時，可以將同組樣本混合后再標記，便可以通過一次上機檢測；技術重復，通常是同一個樣本用不同標記物標記，這樣可以排除因蛋白提取、酶解、標記等操作引入的誤差；另外iTRAQ實驗有時會設計上機重復，這其實也屬于技術重復的范疇，即相同的樣本上兩次機，來排除操作誤差和儀器誤差。目前發SCI論文一般需要設置重復(無論何種重復)，否則可能會被質疑數據的準確性；另外從數據質量上講，重復能更有效的幫助我們排除不可信蛋白，無論是對WB驗證還是后續研究，都是很有利的。
8、iTRAQ的重復性好不好？
iTRAQ重復性通常是指定量的重復性，即同樣的樣本在上機兩次時得到的結果是否一致；iTRAQ實驗重復性的好壞就決定了數據的準確性。一般來說，由于質譜選取肽段的隨機性，可能導致檢測到的肽段及其強度不同，在經過軟件匹配分析后，得到的蛋白比值可能會不一樣。一般得分和比值比較靠后的蛋白才會出現定量的嚴重偏差，而絕大部分蛋白的比值趨勢是一致的。因此在分析時，我們會將鑒定到的蛋白先按FDR(錯誤發現率)或unused值進行篩選，選取置信度大于95%(unused＞1.3)或99%(unused＞2)的蛋白作為可信蛋白，再進行分析。
9、按什么標準來選取差異蛋白？
差異蛋白的選取目前并沒有統一標準，有多種選擇方法，根據比值篩選，結合比值和標準差篩選，或根據T-Test篩選；我們目前一般根據比值進行選擇，即差異倍數≤0.67和≥1.5，有時也會按照p≤0.05的標準過濾。
10、iTRAQ實驗的數據采用不同數據庫檢索時，各組間的比值為何是不同的？
iTRAQ技術中不同標記物之間的比值與檢索數據庫、質譜電信號的噪音以及采集質譜時的隨機性都有關。所以在使用不同數據庫檢索時，由于匹配肽段情況的不同，定量結果也有些許差異，但是總體變化趨勢應是一致的。
11、檢索時為什么同一個編號對應了很多蛋白質？
因為一個蛋白家族中常常含有多個同源性很高的蛋白質，這些蛋白質被酶切之后，很可能會產生很多相同的肽段，軟件在進行定性分析時，就會將這些肽段均歸于得分最高的那種蛋白質，其他同源蛋白不計分，并且這些同源蛋白都采用同一編號。
12、LC/MS中蛋白處理是定量還是定性？
這是屬于定量，需在蛋白定量后，各取相同量(50-100μg)的蛋白(體積不大于25μl，少于25μl的用專用裂解液補至25μl)進行還原化和烷基化。
13、LC/MS對需要檢測的蛋白有量的要求嗎？
有。要求蛋白量最低50μg，濃度最低要為5μg/μL，否則同位素無法標記。
14、數據分析中主要看哪些參數？
對于液質聯用的數據分析，一般觀察的參數為：Total Ion Score C.I. %(可信度)和Tag-80/Tag-0(兩樣本的比值)。
15、眾多可信度數值中，主要選擇哪些進行研究？
一般來說可信度在80%以上的均為可信程度非常高的。有些蛋白可信度在60%以上的也可以作為參考數據。
16、可信程度低于80%的數據有意義嗎？
可信程度低于此值的，如果有感興趣的蛋白可以通過ELISA、WB、Q-PCR、液態芯片等技術手段進一步驗證，畢竟LC/MS是研究蛋白組學的方法之一，如全面研究還是要綜合各種研究方法。
17、兩樣本的比值都代表什么？
兩樣本的比值如果在0.9-1.1之間的，可以認為兩樣本的含量是一樣的，即比值為1:1；而小于0.9或大于1.1均可認為兩樣本之間的比值是有差異的。
18、質譜圖中顯示的是各種蛋白嗎？
不是各種蛋白而是蛋白被打碎后的離子圖譜，由于質譜法是電場和磁場將運動的離子(帶電荷的原子、分子或分子碎片)按它們的質荷比分離后進行檢測的方法。測出的是離子的準確質量，由此來確定離子的化合物組成。
