PKH26熒光細胞連接試劑盒采用擁有專利的膜標記技術，專利膜標記技術，穩定的與細胞膜脂質區結合并發出紅色熒光，染色方式依賴于細胞與膜的類型，主要用于細胞體外標記、體外細胞增殖研究及體內外細胞示示蹤研究。

注意事項和免責說明

該產品僅用于科研，不用于制藥、家庭或其它用途。請遵照安全數據清單中關于有害及安全操作規范操作。

儲存/穩定性

PKH26乙醇溶液冷藏保存。保證染料乙醇溶液瓶蓋蓋緊減少蒸發以防止染料濃度升高。該染料避光保存，使用前觀察是否有結晶。如出現結晶，室溫防止30min，然后超聲或震蕩直至溶解。

稀釋液C可室溫或冷藏保存。如果冷藏保存，使用前復溫至室溫。稀釋液C為無菌溶液，不含任何防腐劑和抗生素，其需保持無菌。不要將染料儲存于稀釋液C中。溶于稀釋液C的工作液需現配現用，且配好后需立即使用。

一般細胞膜標記操作過程

親脂性染料結合到細胞膜上完成標記。染色強度是染料濃度和細胞濃度的函數，與滲透性無關。因此，保證染料添加量不過量非常關鍵。過標記的細胞將會導致細胞膜完整性缺失或降低細胞活性。

下列過程可用于體內體外細胞的標記，包括干細胞、淋巴細胞、單核細胞、內皮細胞、神經細胞或者任何其他細胞。體內細胞的標記過程需一定的改進，如血小板的染色，或者選擇性標記吞噬細胞。

下述染色過程中細胞濃度和染料濃度代表操作的起始濃度。該濃度被證明適用于多種細胞。使用者需通過評估染色后細胞活率（如，PI染色）、熒光強度、染色均勻度及是否對所研究細胞功能有影響等，根據實驗目的，確定最優的染料濃度和細胞濃度。

注意1：PKH26染色過程中，不能存在疊氮化物或代謝毒性物。

注意2：雖然貼壁細胞也可以染色，但單個懸浮細胞染色均一性更佳。因此用蛋白酶（trypsin/EDTA）將貼壁細胞消化成單個懸浮細胞后再染色效果更佳。

下列過程最終體積為2mL，PKH26濃度為2×10-6M，細胞濃度為1×107cells/mL。

以下過程均在室溫下進行（20-25℃）

1. 將2×107個細胞于離心管中，用不含血清培養基洗一遍。

注意：血清蛋白和脂質會與染料結合，降低與細胞膜結合的染料濃度。最好在用稀釋液C重懸細胞染色前（第四步）用無血清培養基或緩沖液洗細胞一次（第一步）。

2. 400×g離心5分鐘。

注意：PKH26染料不能直接加到離心沉淀中，這樣會造成細胞染色不均一和細胞活力降低。

3. 離心后，小心吸棄上層清液，剩余上層細  胞液體積不超過25μL。

注意：為得到可重復的實驗結果，在用稀釋液C重懸時，減少殘留培養基或緩沖液體積非常重要。見參考文獻9的注意28。

4. 加入1mL稀釋液C用移液管輕輕吹打混勻，制備  2×細胞懸液。不要用振蕩器震蕩，不要讓  細胞在稀釋液C中保存太長時間。

注意：生理鹽（physiologic salts）的存在會使得染料結團并大幅降低染色效率。因此，需確保染色時細胞懸浮于稀釋液C中，不含培養基或緩沖鹽。

5. 臨染色之前，將4μL PKH26乙醇溶液加  入1mL稀釋液C中，充分混勻，配制的  2×染色液（4×10-6M）。

注意1：為減少乙醇對細胞活率的影響，步驟5加入的染料使得步驟6中乙醇最終濃度不能超過1-2%。

注意2：如果所需染料最終濃度＜2×10-6M，需用100%乙醇將PKH26稀釋于另一單獨的容器中，以確保實驗結果的可重復性。

6. 快速將1mL 2×細胞懸液（步驟4）加入  1mL 2×染色液（步驟5）中，立即用移液  管混勻。最終細胞濃度為1×107/mL，

  PKH26濃度為2×10-6M。

注意：由于染色瞬間完成，快速將細胞與染料混勻對得到明亮、均勻和可重復的標記結果非常重要。下列措施有助于得到較優的結果：

  a.不要將PKH26染料直接加入含2×細胞的稀釋液C中。

  b. 將2×細胞懸液（步驟4）與2×染色液（步驟5）等體積混合。

  c. 調整2×細胞和2×染料的濃度避免染色  體積太小（＜100μL）或太大（＞5mL）。

  d. 用電動移液器快速將細胞和染料混勻。  血清移液管混勻速度太慢而使得染色不  均勻。Racking和旋渦震蕩混勻同樣混勻  較慢，染色均一性較差。

  e. 分配體積盡量準確，以保證樣品與樣品  之間，實驗與實驗之間的可重復性。

7. 混勻后的染色的細胞孵育1-5 min。由于  染色速度較快，延長孵育時間對實驗沒有幫助。

注意：讓細胞在染色液中停留盡量短的時間，同時保證得到理想的染色強度。因為稀釋液C缺少生理性鹽，過長時間的暴露在稀釋液C中會造成某些細胞活力降低。如果不能確定其影響程度，可增加僅作稀釋的對照組和只用乙醇而不用染料染色的對照組。

8. 加入等體積的血清（2mL）或其它合適的蛋白溶液（如1% BSA）終止反應，孵育1min以結合多余的染料。

注意1：血清（或等效的蛋白濃度）為最優的終止液。如果用完全培養基替代，添加體積為10mL。

注意2：不要通過加稀釋液C或離心來終止反應。

注意3：不要用無血清培養基或緩沖鹽，他們會使染料產生聚集。染料聚集使清洗過程中無法洗凈，使得分析過程中仍存在未標記的細胞。

9. 將細胞在20-25℃條件下400×g離心10min，小心吸棄上清。用10mL完全培養基重懸，將重懸液轉移至另一新的無菌離  心管中，20-25℃條件下400×g離心5 min。用10mL完全培養基再清洗兩遍以除去沒  結合的染料。

注意1：將重懸液轉移至新離心管中，減少了離心管壁殘留的染料對洗滌效率的影響；

注意2：不要用稀釋液C清洗。

10. 最后一步清洗后，用10mL完全培養基重懸細胞評估細胞回收率，細胞活率和熒 光強度（圖2。離心重懸細胞至所需活細  胞濃度。

注意1：染色后的細胞可以用中性甲醛固定，避光條件下，熒光強度至少3周內保持穩定。

注意2：染色熒光強度一般為背景的100-1000倍。雖然染色的CV值與細胞種類有關，但熒光分布應該盡量均勻對稱。

圖2. PKH26染色優化

MC-38 TIL細胞用上述指定PKH26濃度染色，最終細胞濃度為1×107/ml。活力（▲）由FITC染色測定，平均熒光強度（●）用流式細胞儀檢測。用20μM PKH26標記后，抗腫瘤TIL特異性和效能沒有改變。