乳糖含量檢測試劑盒
乳糖在β-半乳糖苷酶作用下分解成半乳糖和葡萄糖，葡萄糖被特異性酶氧化產生與顯色劑反應的(粉)紅色產物，該產物在 510nm處有最大吸收峰，通過校正游離的葡萄糖背景值進而得到乳糖含量。
試劑盒組分與配制：
試劑名稱 | 規格 | 保存要求 | 備注 |
提取液 A1 | 粉體 mg×1支 | 4℃保存 | 臨用前甩幾下使粉劑落入底部，再加 2mL的蒸餾水充分溶解備用。 |
提取液 A2 | 粉體 mg×1支 | 4℃保存 | 臨用前甩幾下使粉劑落入底部，再加 2mL的蒸餾水充分溶解備用。 |
試劑一 | 液體μL×1支 | 4℃保存 | 臨用前甩幾下或離心，使微量液體落入底部，再加 0.6mL蒸餾水混勻 |
試劑二 | 液體 5mL×1瓶 | 4℃保存 | |
試劑三 | 液體 10mL×1瓶 | 4℃保存 | |
試劑四 | 液體 mL×1瓶 | 4℃保存 | 臨用前加 9mL試劑三混勻備用 |
試劑五 | 粉體 mg×1支 | -20℃保存 | 臨用前甩幾下或離心，使粉體落入底部，再加 1.1mL蒸餾水溶解備用。 |
標準品 | 粉體 mg×1支 | 4℃保存 | 臨用前甩幾下或離心，使粉體落入底部再加 2mL蒸餾水溶解即 5mg/mL的葡萄糖，再用蒸餾水稀釋成 0.3mg/mL備用測定。 |
可見分光光度計、1mL玻璃比色皿(光徑 1cm)、天平、移液器、研缽、離心機、蒸餾水。
乳糖含量檢測：
建議正式實驗前選取 2個樣本做預測定，了解本批樣品情況，熟悉實驗流程，避免實驗樣本和試劑浪費！
1、樣本制備：
①組織樣本：0.1g組織樣本(水分充足的樣本建議取 0.2g左右)，加 1mL的蒸餾水研磨，粗提液全部轉移到 EP管中，12000rpm，常溫離心 10min，上清液待測。
②液體樣品：近似中性的澄清液體樣本可直接檢測；若為酸性樣本則需先用 NaOH(2M)調 PH值約 7.4，然后室溫靜置30min，取澄清液體直接檢測。可選取幾個樣本，進行不同倍數的稀釋，選取適合本次樣本的稀釋倍數 D。
③高蛋白含量組織樣本：稱取約 0.1g樣本(水分充足的樣本建議取 0.2g左右)，加 0.9mL的蒸餾水研磨，粗提液全部轉移到 EP管中，加入 0.05mL提取液 A1，混勻后加入
0.05mL提取液 A2，混勻，用蒸餾水定容到 1mL，室溫靜置 30min，若有脂肪除去上層脂肪，12000rpm室溫離心10min，取澄清的液體檢測。
2、上機檢測：
①可見分光光度計預熱 30min，設置溫度在 25℃，設定波長到 510nm，蒸餾水調零。
②所有試劑解凍至室溫(25℃)。
③做實驗前可以選取幾個樣本做預測定，若待檢測指標含量較高可通過用蒸餾水稀釋找出適合本次檢測樣本的稀釋倍數 D。
④在 EP管中依次加入：
試劑名稱(μL) | 測定管 | 對照管 | 標準管(僅做一次) | 空白管(僅做一次) |
樣本 | 40 | 40 | ||
標準品 | 40 | |||
蒸餾水 | 80 | 100 | 100 | 140 |
試劑一 | 20 | |||
試劑二 | 100 | 100 | 100 | 100 |
混勻，25℃條件下孵育20min | ||||
試劑四 | 480 | 480 | 480 | 480 |
試劑五 | 20 | 20 | 20 | 20 |
混勻，37℃條件下避光孵育 30min，全部液體轉移至 1mL玻璃比色皿(光徑 1cm)，于 510nm下讀取吸光值 A，△A=A測定-A對照(每個樣本做一個自身對照)。 | ||||
【注】1.若對照管的 A值超過 0.6，樣本需用蒸餾水進行稀釋，稀釋倍數 D代入計算公式。
2.若△A的值低于 0.01，可增加樣本加樣體積 V1(如增至 80μL，則蒸餾水相應減少)，改變后的 V1代入計算公式重新計算。
五、結果計算：
1、按照質量計算：
乳糖含量(mg/g鮮重)=(C標準×V1)×△A÷(A標準-A空白) ×342.3÷180.16÷(W×V1÷V) ×D
=0.57×△A÷(A標準-A空白)÷W×D
2、按照體積計算：
乳糖含量(mg/mL)=(C標準×V1)×△A÷(A標準-A空白) ×342.3÷180.16÷V1×D
=0.57×△A÷(A標準-A空白)×D
乳糖分子量----342.3；葡萄糖分子量----180.16；
C標準---葡萄糖標準品的濃度，0.3mg/mL； V----加入提取液體積，1mL；
V1----加入樣本體積，0.04mL； W----樣本鮮重，g；
D----稀釋倍數，未稀釋即為 1。
