在生命活動的代謝過程中不斷產生各種自由基，而自由基的積累會使機體產生氧化損傷而引起衰老、腫瘤、中風、心肌炎和糖尿病等慢性疾病，在眾多自由基中 2，2-二苯基-1-苦基苯肼( DPPH)是一種較穩定的自由基，當有自由基清除劑存在時顏色由紫色向黃色轉變，吸光度隨之變小。

DPPH自由基清除率檢測試劑盒(微板法)又稱氮自由基清除能力檢測試劑盒或氮自由基清除率檢測試劑盒，其檢測原理是 DPPH自由基是一種較穩定的含氮自由基，含一個單電子，溶于乙醇后溶液呈紫色，在 517nm下有強吸收，如果有其他物質提供一個電子與此單電子配對，溶液會褪色，褪色程度與接受電子的量呈正比，通過吸光度下降的程度來反應樣品的氮自由基清除能力，主要用于檢測血清、植物組織、抗氧化類食品、保健品及藥品等樣本。該試劑盒僅用于科研領域，不適用于臨床診斷或其他用途。

產品組成

自備材料：

1、蒸餾水、無水乙醇

2、實驗材料：植物組織(芹菜、綠豆、玉米等葉片)、血液、組織樣本等

3、研缽或勻漿器或粉碎機或超聲破碎機

4、離心機、離心管

5、恒溫水浴鍋、恒溫干燥箱

6、電子天平、30～50目篩

7、酶標儀、96孔板

操作步驟(僅供參考)：

1、準備樣品：

①植物樣品：取新鮮植物樣本，清洗干凈，研缽研碎(粉碎)，干燥箱烘干后過篩，稱取0.05g樣品，加入 0.8ml氮自由基提取液，40℃水浴浸提 30～60min，10000rpm離心10min，上清液待用，4℃保存備用(亦可參考相關資料提取方法提取)。

②血漿、血清和尿液樣品：血漿(用肝素或枸櫞酸鈉抗凝，不宜使用 EDTA抗凝) 4℃5000rpm離心 10min，取上清液待用；血清或尿液樣品可直接測定。

③細胞樣品：按每 5×10⁶個細胞加入 0.8ml氮自由基提取液，超聲破碎(功率 200W，超聲 3s，間隔 10s，重復 30次)，10000rpm離心 10min，取上清液待用。

④果汁、葡萄酒等樣品：按樣品：氮自由基提取液=1：9的比例震蕩混勻，10000rpm離心 10min，上清液待用，4℃保存備用。

⑤高活性樣品：如果樣品中有效濃度較高，可用提取液進行恰當的稀釋。

2、配制維生素 C溶液：將一支 10mg維生素 C充分溶解于 1ml氮自由基提取液中，即成10mg/ml維生素 C溶液；可分成 0.1ml的小份，-20℃保存。

3、配制 Vc標準工作液：如需測線性關系，建議用氮自由基提取液將 10mg/ml維生素 C溶液稀釋至 20、15、10、8、6、4、2μg/ml的 Vc標準工作液；如需清除率約為 100%的陽性對照，建議選用大于 30μg/ml的 Vc標準工作液。

4、酶標儀開機預熱 30min以上，調節波長 517nm(500～530nm亦可)，無水乙醇調零。

5、DPPH加樣：按照下表設置空白管、樣本測定管、樣本對照管、陽性對照管，溶液應按照順序依次加入，混勻，室溫避光靜置 30min。

6、 OD值測定：取 96孔板，將各管溶液依次吸取 300ul加至 96孔板中，用酶標儀檢測各管吸光度值，依次記為 A0、A1、A2、A3。

計算：

陽性對照·DPPH清除率(%)= ( A0- A3)/A0×100%

待測樣本·DPPH清除率(%)=[A0-( A1- A2)]/A0×100%

備注：

A0=空白管的吸光度值

A1=樣本測定管的吸光度值

A2=樣本對照管的吸光度值

A3=陽性對照管的吸光度值

注意事項：

1、正式測定之前建議選擇 2～3個預期差異較大的樣本做預實驗。

2、實驗材料應盡量新鮮，當天提取當天測定。

3、不同樣本清除 DPPH自由基的能力差異很大。

4、如樣本 DPPH清除率大于 90%，應用提取液稀釋；如樣本 DPPH清除率小于 5%，應提高樣本用量以提高有效成分濃度。

5、樣品中不宜添加 Triton、DTT等可能影響氧化還原反應的成分。

6、為了您的安全和健康，請穿實驗服并戴一次性手套操作。

有效期：6個月有效；4℃運輸，4℃保存。

附錄：

標準曲線制作：在室溫條件下按說明書操作，對系列 Vc標準工作液(20、15、10、8、6、4、2、1μg/ml)進行吸光度的測定，其數值及標準曲線如下(僅供參考)：

由上圖可知：Vc標準工作液在 2～8μg/ml時線性關系良好， ·DPPH清除率與 Vc濃度呈正相關，當 Vc濃度大于 10即開始有偏差，Vc濃度大于 12時， ·DPPH清除率大于 90%。