ABTS是一種介體物質(zhì)，用 K2S2O8與 ABTS直接生成穩(wěn)定的陽離子自由基 ABTS+，抗氧化物質(zhì)與 ABTS+發(fā)生反應(yīng)而使反應(yīng)體系褪色。

ABTS+·自由基離子的最大吸收波長為 734nm，所以，用 A734  nm可以檢測 ABTS+·自由基離子的濃度。如果 A734nm減小，表明 ABTS+·自由基離子被清除，進(jìn)而對樣本中 ABTS清除能力進(jìn)行定量分析。

試劑盒的組成和配制：

工作液配置：臨用前將加水溶解后的試劑一和試劑二按照 1:1比例混合，避光反應(yīng) 12h后(二天內(nèi)用完)，再用無水乙醇稀釋 20-30倍備用(使 A空白管在 0.7±0.1，用乙醇稀釋后的液體即工作液最好現(xiàn)配現(xiàn)用)。

所需的儀器和用品：

酶標(biāo)儀、96孔板、低溫離心機、水浴鍋、可調(diào)式移液器、研缽、甲醇、無水乙醇和蒸餾水。

ABTS自由基清除能力測定：

建議正式實驗前選取 2個樣本做預(yù)測定，熟悉實驗流程，避免實驗樣本和試劑浪費！

1、樣本制備：

①組織樣本：

稱取約 0.1g新鮮組織或者稱取約 0.05g烘干樣本(將樣本在 105℃下殺青 3min，然后60℃烘干至恒重，粉碎，過 40目篩，得到烘干樣本)，加入 1mL的 80%甲醇提取液(若鮮樣需研磨均質(zhì))，于 60℃，200-300W條件下超聲提取 30min(間隔 5min振蕩混勻一次)，若有損失需用 80%甲醇定容至 1mL。12000rpm室溫離心 10min，取上清測定。

【注】：若增加樣本量，可按照組織質(zhì)量(g)：提取液體積(mL)為 1：5～10的比例進(jìn)行提取。

②細(xì)菌/細(xì)胞樣本：

先收集細(xì)菌或細(xì)胞到離心管內(nèi)，離心后棄上清；取 500萬細(xì)菌或細(xì)胞加入 1mL的 80%甲醇提取液進(jìn)行勻漿；勻漿后轉(zhuǎn)入  2mL離心管中；于 60℃，200-300W條件下超聲提取 30min(間隔 5min振蕩混勻一次)，若有損失需用 80%甲醇定容至 1mL。12000rpm，離心 10min，取上清置冰上待測。

【注】：若增加樣本量，可按照細(xì)菌/細(xì)胞數(shù)量(10⁴個)：提取液(mL)為 1000～5000: 1比例進(jìn)行提取。

③液體樣本：直接檢測；若渾濁，離心后取上清檢測。

2、上機檢測：

①酶標(biāo)儀預(yù)熱 30min以上，調(diào)節(jié)波長至 734nm。

②不同樣本清除能力不一，可先選取 2個樣本做檢測，若 A測定-A對照接近零，需對樣本進(jìn)行稀釋(用 80%甲醇提取液稀釋)后再檢測，稀釋倍數(shù) D代入公式計算。

③在 96孔板中依次加入：

【注】若一次性樣本較多，可用排槍或者分批檢測，以使測定管的反應(yīng)時間(避光靜置 6min)保持一致。

結(jié)果計算：

1、標(biāo)準(zhǔn)曲線：y = 0.5042x - 1.4213，x是標(biāo)準(zhǔn)品 Trolox質(zhì)量(μg/mL)，y是清除率(%)。

2、ABTS自由基清除率(%)=[(1-(A測定-A對照)÷A空白)×100]%

3、定義：用從標(biāo)準(zhǔn)曲線上獲得的抗氧化劑Trolox的量來表示樣本的ABTS自由基清除能力。

4、按樣本質(zhì)量計算：

ABTS自由基清除能力(μg Trolox/g鮮重)=[(清除率+1.4213)÷0.5042×V1]÷(V1÷V×W)×D=1.983×(清除率+1.4213)÷W×D

舉例：若清除率是 70%，則用 70代入公式計算，即：

ABTS自由基清除能力(μg Trolox/g鮮重)=[(70+1.4213)÷0.5042×V1]÷(V1÷V×W)×D

5、按細(xì)菌或細(xì)胞數(shù)量計算：

ABTS自由基清除能力(μg Trolox/10⁴ cell)=[(清除率+1.4213)÷0.5042×V1]÷(V1÷V×500)×D=1.983×(清除率+1.4213)÷500×D

舉例：若清除率是 70%，則用 70代入公式計算，即：

ABTS自由基清除能力(μg Trolox/10⁴ cell)=[(70+1.4213)÷0.5042×V1]÷(V1÷V×500)×D

6、液體樣本：

ABTS自由基清除能力(μg Trolox/mL)=[(清除率+1.4213)÷0.5042]×D=1.983×(清除率+1.4213)×D

舉例：若清除率是 70%，則用 70代入公式計算，即：

ABTS自由基清除能力(μg Trolox/mL)=[(70+1.4213)÷0.5042]×D

V---加入提取液體積，1 mL；

V1---反應(yīng)中樣品體積，10μL=0.01 mL；

W---樣品質(zhì)量，g；

500---細(xì)菌或細(xì)胞總數(shù)，萬；

Trolox分子量---250.29；

D---稀釋倍數(shù)，未稀釋即為 1；

附：標(biāo)準(zhǔn)曲線制作過程：

1制備標(biāo)準(zhǔn)品母液(1mg/mL)：稱取 2mg標(biāo)準(zhǔn)品即 Trolox至一新 EP管，再加 2mL甲醇充分溶解，即 1mg/mL標(biāo)準(zhǔn)品，備用。

2把母液用甲醇稀釋成以下濃度梯度的標(biāo)準(zhǔn)品：0，20，40，60，80，100μg/mL。也可根據(jù)實際樣本來調(diào)整標(biāo)準(zhǔn)品濃度。

3按照測定管加樣體系操作，依據(jù)結(jié)果即可制作標(biāo)準(zhǔn)曲線。