NADPH氧化酶（NAO）試劑盒
NADPH氧化酶(NAO)是一個典型的膜蛋白，催化 NADPH氧化生成 NADP+，并將電子傳遞給氧原子從而產生超氧陰離子。廣泛存在于動物、植物和真菌中。該酶異常可導致人慢性肉芽腫病(GCD)，在植物中，該酶與其抗病性和各種脅迫有密切關系。
NADPH氧化酶(NAO)將 NADPH氧化為 NADP+的同時生成超氧陰離子(O2 .- )，接著與顯色劑反應生成水溶性的黃色物質。對照通過添加該酶的特異性抑制劑 DPI排除背景值。最終檢測生成的有色物質在 450nm處的吸光值，即可計算得出 NAO酶活性大小。
試劑盒組分與配制：
試劑名稱 | 規格 | 保存條件 | |
提取液 | 液體 60mL×1瓶 | 4℃保存 | |
試劑一 | 液體 0.25mL×1支 | -20℃保存 | 若凝固可放置室溫或 25℃水浴溶解。 |
試劑二 | 液體 1mL×1支 | -20℃保存 | |
試劑三 | 粉體 mg×2支 | -20℃保存 | 用前甩幾下或離心使粉劑落入底部，分別加 0.55mL蒸餾水溶解備用。用不完的試劑分裝后-20℃保存，禁止反復凍融，三天內用完。 |
試劑四 | 液體 1mL×1支 | -20℃保存 |
所需的儀器和用品：
酶標儀、96孔板、低溫臺式離心機、水浴鍋、可調式移液器、研缽、冰、蒸餾水。
NADPH氧化酶(NAO)活性測定：
建議正式實驗前選取 2個樣本做預測定，了解本批樣品情況，熟悉實驗流程，避免實驗樣本和試劑浪費！
1、樣本制備
①組織樣本：
取約 0.1g組織，加入 1mL提取液，在 4oC或冰浴進行勻漿(或使用各類常見勻漿器)。4oC×12000rpm離心 10min，取上清作為待測液。
【注】：若增加樣本量，可按照組織質量(g)：提取液體積(mL)為 1：5～10的比例進行提取
②細菌/細胞樣本：
先收集細菌或細胞到離心管內，離心后棄上清；取約 500萬細菌或細胞加入 1mL提取液，超聲波破碎細菌或細胞(冰浴，功率 200W，超聲 3s，間隔 10s，重復 30次)；12000rpm 4℃離心 10min，取上清，置冰上待測。
【注】：若增加樣本量，可按照細菌/細胞數量(104)：提取液(mL)為 500～1000：1的比例進行提取。
③液體樣本：直接檢測；若渾濁，離心后取上清檢測。
2、上機檢測：
①酶標儀預熱 30min以上，設定溫度 37℃，調節波長至 450nm。
②所有試劑解凍至室溫(25℃)。
③在 96孔板中依次加入：
試劑名稱(μL) | 測定管 | 對照管 |
樣本 | 20 | 20 |
提取液 | 150 | 145 |
| 試劑一 | 5 | |
| 37℃孵育 5min(可能會產生沉淀，但不影響后續測定) | ||
| 試劑二 | 10 | 10 |
| 試劑三 | 10 | 10 |
| 試劑四 | 10 | 10 |
| 37℃避光孵育 20min，于 450nm讀取吸光值 A，ΔA=A測定-A對照。 | ||
【注】若△A的值在零附近，可以延長反應時間 T(如至 40min或更長)，則改變后的反應時間 T需代入公式重新計算。
結果計算：
1、按樣本蛋白濃度計算：
酶活定義：每毫克組織蛋白每分鐘在反應體系中使 450nm處吸光值變化 0.01為一酶活單位。
NAO(△OD450/min/mg prot)=ΔA÷(V1×Cpr)÷0.01÷T=250×ΔA÷Cpr
2、按樣本鮮重計算：
酶活定義：每克組織每分鐘在反應體系中使 450nm處吸光值變化 0.01為一酶活單位。
NAO(△OD450/min/g鮮重)=ΔA÷(W×V1÷V)÷0.01÷T=250×ΔA÷W
3、按細菌或細胞密度計算：
酶活定義：每 1萬個細菌或細胞每分鐘在反應體系中使 450nm處吸光值變化 0.01為一酶活單位。
NAO(△OD450/min/104 cell)=ΔA÷(500×V1÷V)÷0.01÷T=0.5×ΔA
V---加入提取液體積，1mL；
V1---加入樣本體積，0.02mL；
T---反應時間，20min；
W---樣本質量，g；
500---細胞或細菌總數，萬；
Cpr---樣本蛋白質濃度，mg/mL；
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